(1) 实验前准备。包括纯化重组蛋白及合成DNA探针。(2) 标记探针。在合成的DNA探针上标记放射性同位素³²P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等优点, 近年来人们常使用生物素标记DNA探针。按照以下顺序配制标记组和竞争组的反应体系。标记组: 12.5 μL超纯水, 5 μL5× TdT缓冲液, 2.5 μL 1 μmol∙L^–1未标记的Oligo, 2.5μL 5 μmol∙L^–1 Biotin-11-UTP, 2.5 μL 2U∙μL^–1 Diluted TdT。竞争组: 20 μL超纯水, 2.5μL 10×结合缓冲液(含Mg² ), 2.5 μL 50 μmol∙L^–1未标记的Oligo。37°C避光孵育30分钟。加入1.25 μL 0.2 mol∙L^–1 EDTA终止反应, 然后加入25 μL氯仿:异戊醇(1:1), 旋涡振荡混匀, 16000 ×g离心1–2分钟, 取上清。随后转移至90°C孵育2分钟, 缓慢降温至60°C, 最后于60°C孵育30分钟。(3) 6% TBE凝胶制备及预电泳。按照配方依次加入各成分并充分混匀, 注意在灌胶过程中要防止气泡的产生。待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳, 90 V电泳1–2小时, 电泳缓冲液为0.5× TBE缓冲液。(4) 蛋白与探针结合反应。按照以下配方配制结合反应体系。实验组: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL标记探针, 6 μL结合反应缓冲液, 用超纯水定容至20 μL。竞争组: 50 ng融合蛋白, 0.5–2μL标记探针, 过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针, 6 μL结合反应缓冲液, 用超纯水定容至20 μL。其中, 结合缓冲液的配方为:2 μL 10×结合缓冲液, 1 μL 50%丙三醇, 1 μL100 mmol∙L^–1 MgCl₂,1 μL

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1 μg∙μL^–1 Poly dI:dC, 1 μL 1% NP-40。  通常未标记野生型或突变型探针的用量为标记探针的10倍、50倍和100倍。Poly dI:dC可抑制蛋白与DNA的非特异性结合, 避免形成假复合物。(5) 电泳。结合反应完毕后加入5 μL上样缓冲液, 充分混匀再进行上样。电压90 V, 待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳。(6) 转膜。将尼龙膜小心取出, 放入0.5× TBE转膜缓冲液中, 依次按照黑面-纤维垫-2层滤纸-胶-尼龙膜-2层滤纸-纤维垫-白面的顺序放置,注意不要有气泡产生。380 mA工作60分钟。(7) 紫外交联。取出尼龙膜用吸水纸吸干水, 蛋白面朝下放入紫外交联仪中, 紫外交联15分钟。(8) 发光检测。将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中, 加入10 mL封闭缓冲液, 轻柔摇动15分钟。轻轻倒掉封闭缓冲液, 加入8 mL结合/封闭缓冲液, 轻柔摇动15分钟。将尼龙膜转移至新的平皿中, 加入10 mL 1×漂洗液, 轻柔漂洗5分钟, 重复漂洗3次。将尼龙膜转移至新的平皿中, 加入15 mL底物平衡缓冲液, 轻柔摇动15分钟。取出尼龙膜, 吸干多余的底物平衡缓冲液, 置于新的平皿中。加入6 mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜, 静置孵育5分钟。最后, 取出尼龙膜, 从侧面吸干多余的化学发光底物, 用保鲜膜包被, 在化学发光成像系统(Bio-step)中曝光5分钟进行显影。(9)数据分析。通常情况下, 可以从两方面分析EMSA数据, 即底部的自由探针和位于上方的迁移条带(蛋白-DNA复合物)。在加入等量标记探针的前提下, 当蛋白与DNA产生互作时, 底部的自由探针减少, 迁移条带亮度增强。在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白, 此时自由探针条带强度基本不变, 迁移条带亮度减弱; 而当增加未标记的突变探针时, 由于蛋白不结合该序列,突变探针不与标记探针竞争, 此时自由探针减少, 迁移条带亮度增强(Jiang et al., 2016)。

一.材料和方法 （一）材料： Nuclear Extract Kit( Active Motif North America) 抽提核蛋白；BCA蛋白定量试剂盒；XXX细胞；抗体A； Merck Millipore ChromatinImmunoprecipitation Kit （Merck Millipore）；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、1xPBS、 Penicillin streptomycin solution、0.25%胰酶溶液均购自美国Gibco公司；Chemiluminescent Nucleic AcidDetection Module、Light Shift Chemilinescent EMSA Kit为美国Thermoscientific公司产品；Nuclear Extract Kit为Active Motif North America公司产品。 （二）方法 凝胶迁移阻滞实验的具体操作步骤如下： 1. 制备生物素标记探针 1). 在Invitrogen公司合成探针序列，见下表。探针制备反应体系为，25μl超纯水、10μl的5×TdT Reaction Buffer、5μl探针(1μM)、5μl Biotin-N4-CTP、5μl TdT (2U/μl)温和混匀，37℃反应30min。 2). 加入2.5μl0.2M EDTA终止反应；加入50μl氯仿，短暂涡旋振荡，12000rpm离心2min，保留上层水相，-20℃保存；结合反应前等体积混合两条标记引物，95℃退火引物，自然冷却至室温，4℃保存待用。 2. 抽提核蛋白 在250px培养皿中种植1×107个XXX细胞，培养约12h，收集细胞。用Nuclear Extract Kit – ActiveMotif North America 抽提核蛋白，并用BCA蛋白定量的方法测定蛋白浓度。 3. 制胶 配制6.5%的非变性胶，长沙EMSA实验_长春EMSA实验外包_西安淳风生物科技有限公司，其配方如下：1ml10×TBE、3.3ml 40% Acrylamide、1ml 50% Glycerol、14.8ml dH2O、20µl TEMED（四甲基乙二氨），混匀脱气10min后再加入120µl 10%过硫酸氨（AP）混匀灌胶。 4. EMSA结合反应 结合反应体系为：2μl的10×Bindingbuffer、1μl的Poly(dIdC)、5μl的SGC7901 Nuclear extract（6μg/μl）、2μl的Biotin Probe（约12.5fmol/μl）、2μl的Antibody、dd H2O补齐20μl。另外，使用过量未标记的冷探针进行竞争性实验，即4ul的WT-probe（约12.5fmol/μl）；使用突变探针4μl的(Mut-probe)（约12.5fmol/μl）作为对照。使用相应的抗体进行超迁移率实验（Supershift assay）。 1) 将结合反应的混合物用无菌枪头轻轻的混合均匀，置于冰上反应20min，然后加入生物素标记的探针；室温继续反应20min，加入6×LoadingBuffer(Takara)4μl，上样体积为10~30μl，长沙EMSA实验_成都EMSA技术服务_西安淳风生物科技有限公司，100V电泳至溴酚蓝于四分之三凝胶处； 2) 进行电转前将NC膜浸泡于新鲜配制的0.5×TBE缓冲液中至少10min；以℃预冷的0.5×TBE为电转缓冲液，在恒压100V的条件下，至冰上进行转膜，约45min可完成转胶于尼龙膜上； 3) UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以1200×100UJ/cm2，紫外交联5min；加入25mLBlocking Buffer ，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min； 4) 将66.7μl稳定的链霉亲和素（SA-HRP）以1:300稀释于20ml Blocking Buffer，长沙EMSA实验_武汉EMSA技术服务_西安淳风生物科技有限公司，脱色摇床70rpm共轭结合作用20min； 5) 加入1×洗膜缓冲液，洗膜过程全部在脱色摇床上进行（140prm)，完毕后wash buffer 30ml洗涤4次，每次15min； 6) 将膜用滤纸稍适吸干配制1:1稀释的发光反应液（Thermo公司，EMSA化学发光试剂盒）均匀的铺于NC膜上，作用1-5min，赶走气泡，于LAS4000上采集图像，检测信号。 实验原理 EMSA是一种研究转录因子与DNA结合的实验技术, 可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白和同位素或生物素标记的DNA探针共同孵育, 然后在非变性聚丙烯凝胶上电泳, 从而将DNA-转录因子复合物与不结合的探针分离。由于分子量变大, DNA-转录因子复合物比不结合的探针迁移速度慢, 因此转录因子结合标记探针后使自由探针含量减少。研究者通常按照上述2个标准判断转录因子是否结合DNA。