蛋白质体外结合实验（GST pull-down 技术）_GST-pull down

GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作。实验操作流程如下：1.诱导与转化：将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中A.质粒加入细菌B.冰上30minC.42℃水浴5s或1minD.向转化混合物中加入500µLLB，不加抗生素，160rpm37℃摇床振荡1hE.涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板F.挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）G.将阳性克隆加入至3mLLB培养液，220rpm37℃过夜小摇H.取200µL菌液加入20mLLB培养液（50mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220rpm37℃4-6小时I.菌液呈浑浊状后检测OD值，OD值0.6时加入0.5mM的IPTG，继续摇菌4小时J.5000rpm离心10min后收集菌体，去除上清2.裂解细菌：A.向菌体中加入1mL含1x蛋白酶抑制剂的BC100缓冲液（不含TritonX-100）重新悬浮细菌。B.将步骤A中的菌体悬液转移至1.5mLEP管中，置于冰上。超声裂解细菌，超声30秒，冰上静置30秒，共反复5次。C.超声后加入110µL10%TritonX-100,4℃震荡1h。D.4℃，12000rpm离心30分钟。收集上清液。E.取20µL上清，加入loadingbuffer，煮蛋白后SDS凝胶电泳，以考马斯亮兰染色检测蛋白表达。留40µL裂解液作为input。3.GST融合蛋白的纯化：A.清洗beads:用含0.1%TritonX-100的BC100缓冲液洗20µLGST-sepharosebeads，5000rpm离心30秒2次，共清洗3次。B.重悬beads:以BC100缓冲液1：1重悬GST-sepharosebeads。C.孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharosebeads中。4℃震荡孵育1小时。D.收集beads:5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。E.清洗beads:吸出上清，用1mLBC500缓冲液（含1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。F.清洗beads:以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。5000rpm离心30秒，两次，沉淀beadsG.以300µLBC100缓冲液重悬beads（含0.1%TritonX-100）。4.His融合蛋白的纯化：采用His-taggedproteinpurificationMagbeads（Absin,中国）进行His融合蛋白的纯化，按照制造商的使用说明进行操作。A.取0.3mL的磁珠，磁性分离，washingbuffer清洗3次。B.细菌裂解液加入磁珠中，4℃震荡孵育1小时，washingbuffer清洗3次，每次清洗后均磁性分离磁珠。C.在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液。反复3次。D.将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白。5.蛋白结合及检测：A.纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。B.吸出上清。以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100）清洗beads3次。C.加入1xloadingbuffer50µL，连同input样本，95℃金属浴5min。离心分离beads，取上清进行Westernblot检测。

查看蛋白质体外结合实验（GST pull-down 技术）_GST-pull down全部详情 >>