14℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶活性分析建议用2h室温孵育。1加入100ulProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2ul"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）!114000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800ul/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。

　　9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次.用NETN洗一次；6．吸出混合物的液体部分！加入800ul的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min；10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11．通过窄孔高效液相色谱分离肽.

　　西安淳风生物科技有限公司坐落于陕西省西安市雁塔区长安南路86号澳城大厦，是陕西西安雁塔区知名企业，公司业务联系人：17791388172， 期待您的来电咨询更多关于Co-IP相关信息！

西宁Co-IP实验

　　实验目的：确定两种目标蛋白质是否在活体细胞体内相互作用，也可用于确定一种特定蛋白质的新的相互作用搭档。操作步骤：适用范围依据抗体类型（蛋白质X自身特异性抗体、蛋白质X融合商品化标签抗体）。本方法试例举：蛋白质X融合FLAG标签，将该载体转基因转入水稻获得稳定转基因植株，然后用FLAG标签抗体利用Co-IP方法沉淀与蛋白质X互作的蛋白质复合物，用Westernblot方法检测蛋白质Y是否一起被沉淀下来，以确定在水稻体内蛋白质X和蛋白质Y是否真正相互作用！

　　目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的.这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档!试剂准备预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机!用预冷的PBS洗涤细胞两次，一次吸干PBS。加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0！

　　取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min.于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中.用0!22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测！Anti-FLAGM2AffinityGel预处理。取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中.于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之！

　　5ml/5x106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）！用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠！每1ml总蛋白中加入100ulProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景!

　　1用60ul2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60ul足够上三道）.1将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性！免疫共沉淀反应1．转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°C，离心30min后取上清；2．取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1ug相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；3．取10ulproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min；．将预处理过的10ulproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；5．免疫沉淀反应后，在4°C以3000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；加入15ul的2xSDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；6．SDS-PAGE，Westernblotting或质谱仪分析！