在此过程中，与DNA结合的蛋白质将被捕获并保留下来，而未结合的蛋白质和其他杂质则被洗脱！洗脱和分析：通过洗脱步骤将蛋白质从亲和介质上解离开来!可以使用不同的方法洗脱，如改变pH值、加入竞争性结合物等！而后，洗脱后的蛋白质可以通过Westernblotting、质谱分析等技术进行进一步的鉴定和分析！具体的实验条件和步骤可能因实验目的和样品类型而有所不同，并且实验中的各操作均需遵循相关实验室安全操作规程。

　　背景说明DNApulldown以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，比较常见的应用是寻找某特定基因启动子的转录因子！启动子通常位于结构基因5端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列.转录因子也称反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能与真核基因的顺式作用元件（如启动子、增强子等）特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核定位信号控制转录因子进入细胞核。

福州DNA pull down公司

　　 西安淳风生物科技有限公司西安淳风生物科技有限公司，我们巍峨耸立于陕西省西安市雁塔区长安南路86号澳城大厦，我们在这里等待您的到来。 也可以通过电话联系： 联系方式:17791388172 联系人: 致电我们，有意向不到的惊喜!

　　1．探针设计及标记①采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；②将其克隆至pMD-18T克隆载体，并测序鉴定成功；③使用PCR法或末端标记法标记探针；④标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；⑤-20℃保存，待用；2．Pulldown①预先混合5µg生物素标记的DNA和500µg核蛋白，置于冰上；②取100μL串珠，用冰冷PBS洗一次，5000g离心30秒；③将DNA与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子；④4℃孵育1小时；⑤5000g，离心30秒，去除上清，收集沉淀；⑥用冰冷PBS洗串珠三次，5000g离心1分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；⑦加入30μL蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟，3．蛋白质检测--WesternBlot①电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；②转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。

　　000ns；12真空度4×10-7Torr；13质谱信号单次扫描累加200次；14使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；15样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；16利用LIFT软件将PMF强度较大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）!Pulldown技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。

　　DNA探针标记：将DNA探针标记上特定的分子或荧光染料，常用的标记方法包括生物素化、荧光标记等！这样做的目的是便于后续步骤中检测和纯化与DNA结合的蛋白质。细胞提取：收集感兴趣的细胞系或组织，使用细胞裂解缓冲液将细胞打断并释放出细胞内成分。蛋白质-DNA结合反应：将标记的DNA探针加入细胞提取物中，使其与细胞提取中的蛋白质发生特异性结合.DNApulldown：将混合物通过亲和纯化柱（如琼脂糖亲和柱）或磁珠（如磁珠上的生物素）进行过滤或沉淀.　　其次，下半年虽然需求将由旺转平，但技术进步、规模效益、强化管理等成效会依然持续。例如，2008年、2009年的新产品产值同比增幅分别为　11.5%和7.5%，2010年上半年该增幅已上升至43.46%，新产品占比已达到16.04%;2010年1～5月行业的产销增幅达30%，但产品库存增幅仅为7.31%，流动资金余额、应收账款、负债、管理费用、财务费用等数据都低于产销升幅。下半年，上述数据将转平缓，但不会快速上升并导致利润大幅下降。此外，成本上升压力不大。年初曾出现一轮原材料、元器件的涨势，但年中已趋缓回落，预计下半年再掀涨势的几率不大。