实验原理：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于研究两个蛋白质在活体细胞内生理性相互作用的经典的方法!当活体细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，与X在细胞内结合的蛋白质Y可以与蛋白质X一起以复合物的形式被沉淀下来，然后经Westernblot或质谱的方法对蛋白质Y进行检测或鉴定。

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　　4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子!9．（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）！10。用PBS将总蛋白稀释到约1ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10ug/ul）!1加入一定体积的兔抗到500ul总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异！

正宗Co-IP实验

　　14℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶活性分析建议用2h室温孵育!1加入100ulProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2ul"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）.114000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800ul/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS！

我们推荐Co-IP实验

　　将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序.注意事项：细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）！每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定!不能用高浓度的变性剂（0!2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的!使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用!使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

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　　取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min。于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中！用0!22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测。Anti-FLAGM2AffinityGel预处理！取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中。于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。

　　实验目的：确定两种目标蛋白质是否在活体细胞体内相互作用，也可用于确定一种特定蛋白质的新的相互作用搭档！操作步骤：适用范围依据抗体类型（蛋白质X自身特异性抗体、蛋白质X融合商品化标签抗体）.本方法试例举：蛋白质X融合FLAG标签，将该载体转基因转入水稻获得稳定转基因植株，然后用FLAG标签抗体利用Co-IP方法沉淀与蛋白质X互作的蛋白质复合物，用Westernblot方法检测蛋白质Y是否一起被沉淀下来，以确定在水稻体内蛋白质X和蛋白质Y是否真正相互作用！