22μm滤膜抽滤，-20℃保存。3GST融合蛋白的纯化（15）从–80°C冰箱中拿出冻存的样品,冰浴溶解菌体后,加入4mLPBS和40μLPMSF(100mmol！L–1)和40μL蛋白酶抑制剂Cocktail(100X)进行充分重悬;（还有这种做法：每升菌液约以50mLPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1mM））细胞裂解需要采用温和的裂解条件（问下天地人和细胞裂解液配方GST的）.

　　 如果您看到这段话，说明您对我们蛋白质体外结合实验（GST pull-down 技术）感兴趣，不要犹豫，给我们一个机会，也给自己一个机会。 拿起手机来拨打我们的电话。等待着您的每一次致电：17791388172 让西安淳风生物科技有限公司为您服务， 我们在陕西省西安市雁塔区长安南路86号澳城大厦这里等您。

　　5000rpm离心30秒，两次，沉淀beadsG!以300µLBC100缓冲液重悬beads（含0.1%TritonX-100）.His融合蛋白的纯化：采用His-taggedproteinpurificationMagbeads（Absin,中国）进行His融合蛋白的纯化，按照制造商的使用说明进行操作!A！取0!3mL的磁珠，磁性分离，washingbuffer清洗3次！B。细菌裂解液加入磁珠中，4℃震荡孵育1小时，washingbuffer清洗3次，每次清洗后均磁性分离磁珠。

　　为了不破坏细胞内存在的蛋白与蛋白之间的相互作用,多采用非离子变性剂(NP-40或TritonX-100),不能采用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要添加各种酶的抑制剂！（16）超声破碎,频率:100~200瓦;超声40秒,停止20秒,共5次(菌体由浑浊变为澄清);（17）4°C,15000rpm离心40分钟;（18）冰上转移细胞裂解液上清至洁净的10mL离心管中;（19）在细胞裂解液上清中加入50μL50%GlutathioneSepharose4B,4°C,静音混合器上温和旋转孵育30–60分钟;（20）3000rpm离心5分钟,弃上清,此时Sepharose上即结合了GST融合蛋白或GST;（21）在管中加入预冷的500μLPBS(沿壁加入,动作轻柔,以免打断珠子与蛋白的联接),轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤1次,3000rpm离心3分钟,弃上清;（22）反复用PBS洗涤3次(最后用小枪吸净珠子表面水膜),即获得结合有GST融合蛋白或GST的Sepharose,用大口径的移液枪头转移至5mL尖底离心管中;（23）如果用于检测,在Sepharose加入15–20μL1xSDS蛋白上样缓冲液,在沸水中煮3分钟,12000rpm离心1分钟,取上清作SDS-PAGE电泳;（24）如果用于Pull-down检测,继续后续操作。

高品质济南GST-pull down公司

　　GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用!目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）！结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作.

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　　实验操作流程如下：诱导与转化：将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中A!质粒加入细菌B.冰上30minC!42℃水浴5s或1minD.向转化混合物中加入500µLLB，不加抗生素，160rpm37℃摇床振荡1hE!涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板F。挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）G！将阳性克隆加入至3mLLB培养液，220rpm37℃过夜小摇H.取200µL菌液加入20mLLB培养液（50mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220rpm37℃4-6小时I!

　　50%GSTSepharose4Bslurry的准备（11）将原75%GlutathioneSepharose4Bslurry弹至均匀;（12）取677μL原液/管,3000rpm,离心5分钟,弃上清;（13）加500μLPBS,颠倒混匀,3000rpm,离心5分钟,弃上清,反复5次;（14）加500μLPBS,颠倒混匀,配成50%GlutathioneSepharose4B备用!100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：38gIPTG溶于100mlddH2O中，0!