背景说明

 

    DNA pull down以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，比较常见的应用是寻找某特定基因启动子的转录因子。

 

启动子通常位于结构基因5"端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。转录因子也称反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能与真核基因的顺式作用元件（如启动子、增强子等）特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核定位信号控制转录因子进入细胞核。

 

一个基因的启动子通常会结合多种转录因子，寻找启动子的特异转录因子，有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。

 

▼应用场景

    

         DNA pull down用于研究DNA结合蛋白和特定的DNA序列的相互作用。

 

▼实验原理

 

   DNA pull down是一种研究DNA与蛋白互作的方法。其原理是：生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与核蛋白孵育，从而捕获并纯化出与DNA片段互作的蛋白。捕获的蛋白一方面可以通过Western blot验证某一特定蛋白是否与靶DNA片段结合；另一方面也可以进行质谱鉴定，筛选出与DNA片段可能互作的蛋白质。

 

▼我们的优势

 

1.      

表达蛋白时有自研改造的适合不同蛋白表达的标签载体，确保表达出可溶性蛋白；

2.      

 

原核表达对培养基、温度、ph、时间、分子伴侣等进行优化组合，确保可溶性蛋白产量；

3.      

 

添加各种裂解液和蛋白酶抑制剂的超声破碎缓冲液，确保蛋白产量；

4.      

 

自研的超滤缓冲液配方，保护蛋白且不影响蛋白和DNA结合；

5.      

Thermo原装试剂标记探针，保证标记效率；

6.      

自研的洗杂液配方，确保非特异结合蛋白的流出

7.      

自研的洗脱液配方，确保生物素探针的完全洗脱

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8.      

 自研封闭液和洗涤液，降低实验背景。

Pull down技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。 DNA pull down实验是用于研究蛋白质和DNA之间相互作用的常用技术。下面是DNA pull down实验的一般流程： DNA探针的制备：首先设计和合成包含目标DNA序列的探针。可以使用化学合成或PCR方法从基因组DNA或质粒中扩增出需要的DNA片段。 DNA探针标记：将DNA探针标记上特定的分子或荧光染料，常用的标记方法包括生物素化、荧光标记等。这样做的目的是便于后续步骤中检测和纯化与DNA结合的蛋白质。 细胞提取：收集感兴趣的细胞系或组织，使用细胞裂解缓冲液将细胞打断并释放出细胞内成分。 蛋白质-DNA结合反应：将标记的DNA探针加入细胞提取物中，使其与细胞提取中的蛋白质发生特异性结合。 DNA pull down：将混合物通过亲和纯化柱（如琼脂糖亲和柱）或磁珠（如磁珠上的生物素）进行过滤或沉淀。在此过程中，与DNA结合的蛋白质将被捕获并保留下来，而未结合的蛋白质和其他杂质则被洗脱。 洗脱和分析：通过洗脱步骤将蛋白质从亲和介质上解离开来。可以使用不同的方法洗脱，如改变pH值、加入竞争性结合物等。而后，洗脱后的蛋白质可以通过Western blotting、质谱分析等技术进行进一步的鉴定和分析。 具体的实验条件和步骤可能因实验目的和样品类型而有所不同，并且实验中的各操作均需遵循相关实验室安全操作规程。 1．探针设计及标记 ① 采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段； ② 将其克隆至pMD-18T克隆载体，并测序鉴定成功； ③ 使用PCR法或末端标记法标记探针； ④ 标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度； ⑤ -20℃保存，待用； 2．Pull down ① 预先混合 5 µg 生物素标记的 DNA 和 500 µg 核蛋白，置于冰上； ② 取 100μL 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 离心 30 秒； ③ 将 DNA 与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子； ④ 4℃孵育 1 小时； ⑤ 5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀； ⑥ 用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀； ⑦  加入 30 μL 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟， 3．蛋白质检测-- Western Blot ① 电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60 ug总蛋白，开始电压为100 v,到达分离胶后调为120 v； ② 转膜：转膜为恒流转膜，电流为200 mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120 min。 ③ 封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。 ④ 孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。 ⑤ 孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。 ⑥ 显色：使用化学发光试剂，长沙DNA pull down技术服务_兰州DNA pull down实验外包_西安淳风生物科技有限公司，长沙DNA pull down技术服务_成都DNA pull down技术服务_西安淳风生物科技有限公司，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。 4．蛋白质检测-- MS ① 切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2 mm），置于1.5mL EP管中。 ② 清洗：用200 uL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。 ③ 脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200uL，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。 ④ 脱水：加ACN 100 μL脱水至胶粒变白，吸弃ACN。 ⑤ 清洗：用200 μL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200uL 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。 ⑥ 脱水：加ACN 100 μL 脱水至胶粒变白，长沙DNA pull down技术服务_成都DNA pull down公司_西安淳风生物科技有限公司，吸弃ACN。 ⑦ 用25 mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30 min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃过夜(16h)。 ⑧ 质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式； ⑨ 离子源加速电压1为24kv； ⑩ 加速电压2为22kv； 11 离子延迟提取0.000ns； 12 真空度1.4×10-7 Torr； 13 质谱信号单次扫描累加200次； 14 使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000； 15 样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除； 16 利用LIFT软件将PMF强度较大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。